化學(xué)發(fā)光標(biāo)記技術(shù)及影響因素

化學(xué)發(fā)光標(biāo)記技術(shù)按照標(biāo)記反應(yīng)的過(guò)程和形成結(jié)合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可分為直接偶聯(lián)和間接偶聯(lián)兩種方式。直接偶聯(lián)是指通過(guò)偶聯(lián)反應(yīng)使標(biāo)記物分子中的反應(yīng)基團(tuán)直接連接在被標(biāo)記物分子的反應(yīng)基團(tuán)上。間接偶聯(lián)的特點(diǎn)是在標(biāo)記物與被標(biāo)記物之間插入一條鏈或一個(gè)基團(tuán)，使兩種物質(zhì)通過(guò)引進(jìn)的“橋”連接成結(jié)合物。通過(guò)插入“橋”可以在原有的結(jié)構(gòu)中引進(jìn)新的活性基團(tuán)、增加反應(yīng)活性，還可以減弱參與偶聯(lián)雙方存在的空間阻礙效應(yīng)。小分子物質(zhì)結(jié)合物主要通過(guò)偶聯(lián)反應(yīng)制備；大分子物質(zhì)結(jié)合物主要交聯(lián)劑使標(biāo)記物與被標(biāo)記物結(jié)構(gòu)中的游離的氨基、羧基、咪唑基、酚基、羥基等形成不可逆連接。

常用的標(biāo)記技術(shù)有以下幾種：

1.碳二亞胺縮合法

水溶性碳二亞胺成功的用于制備大分子-大分子或大分子-半抗原衍生物的交聯(lián)結(jié)合物。經(jīng)過(guò)碳二亞胺縮合反應(yīng)，蛋白質(zhì)分子中的游離羧基能與發(fā)光劑分子中的氨基形成較為穩(wěn)定的酞胺鍵。反應(yīng)條件比較溫和，應(yīng)用范圍廣。結(jié)構(gòu)中含有羧基或氨基的標(biāo)記物均可選用此方法進(jìn)行標(biāo)記?？晒┦褂玫目s合劑有：二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）、1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）-碳二亞胺-HCI（EDC）等。

碳二亞胺縮合法

2.重氮鹽偶聯(lián)法

此法也稱為“重氮化法”是在酸性和低溫條件下，用亞硝酸鹽將發(fā)光劑的伯氨基重氮化得到重氮鹽。再與蛋白質(zhì)作用生成發(fā)光劑-蛋白質(zhì)結(jié)合物。蛋白質(zhì)分子能偶合重氮鹽的位置有酪氨酸殘基上酚羥基鄰位，組氨酸殘基的咪唑環(huán)、色氨酸殘基的吲哚環(huán)等。

重氮化反應(yīng)用于標(biāo)記發(fā)光劑具有簡(jiǎn)便易行、成本低、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。但因反應(yīng)是建立在NO2-與-NH2作用的原理上，若標(biāo)記物結(jié)構(gòu)中無(wú)伯氨基則不易選用此方法。同時(shí)因脂肪族伯氨基與NO2-的反應(yīng)產(chǎn)物不穩(wěn)定，易分解。所以，像ABEI、AHEI等伯氨基位于側(cè)鏈的發(fā)光劑也不能選用此法進(jìn)行直接標(biāo)記。這使重氮化法的應(yīng)用受到一定的限制。

重氮鹽偶聯(lián)法

3.混合酸酐法

結(jié)構(gòu)中含有羧基的分子（標(biāo)記物或被標(biāo)記物）在三乙胺或正三丁胺等的存在下與氯甲酸酯類反應(yīng)，生成活潑的混合酸酐中間體?；旌纤狒芘c另一分子的氨基反應(yīng)形成酰胺鍵連接的共價(jià)化合物。目前采用的氯甲酸甲酯類有氯甲酸乙酯、氯甲酸異丁酯等。

混合酸酐法

4.N-羥基琥珀酰亞胺活化法

一些結(jié)構(gòu)中含有羧基的抗原，經(jīng)過(guò)N-羥基琥珀酰亞胺活化后再與發(fā)光劑的氨基偶聯(lián)成酰胺鍵。含有羧基的發(fā)光劑和催化劑（如血紅素類）也可以經(jīng)過(guò)活化用來(lái)與抗原的氨基偶聯(lián)。

N-羥基琥珀酰亞胺活化法

5.過(guò)碘酸鹽氧化結(jié)合法

此方法也稱為“過(guò)碘酸鈉法”。先是利用過(guò)碘酸鹽氧化糖蛋白中糖基的鄰二羥基成為醛基，然后醛基與伯氨基反應(yīng)形成Schiff堿。Schiff堿經(jīng)NaBH4還原-N=C-鍵成為穩(wěn)定的結(jié)合物。
過(guò)碘酸鈉法也可用于酶免疫測(cè)定中制備酶標(biāo)結(jié)合物。醛氨縮合成的Schiff堿經(jīng)NaBH4還原后的單鍵穩(wěn)定性好，標(biāo)記物不易脫落。凡含有芳香伯胺或脂肪伯胺的標(biāo)記物都可以選用此法。但因過(guò)碘酸鈉法的氧化反應(yīng)需有鄰二羥基存在，所以不適用于無(wú)糖基的蛋白質(zhì)。對(duì)于某些雖含有糖基，但氧化糖基后會(huì)影響免疫學(xué)性質(zhì)的物質(zhì)，也不易選用過(guò)碘酸鈉法進(jìn)行標(biāo)記。

過(guò)碘酸鹽氧化結(jié)合法

6.環(huán)內(nèi)酸酐法

通常用琥珀酸酐作為連接的“橋”，所以又稱為“琥珀酸酐法”。利用環(huán)內(nèi)酸酐與分子中的羥基或氨基反應(yīng)形成半酯或半酰胺。在經(jīng)過(guò)碳二亞胺法或混合酸酐法使其與另一分子中的氨基作用形成酰胺鍵。標(biāo)記物與被標(biāo)記物通過(guò)一個(gè)琥珀酰基連接到一起。該方法的優(yōu)點(diǎn)是避免使用其他雙功能交聯(lián)劑時(shí)存在的副反應(yīng)。保證標(biāo)記物和蛋白質(zhì)分子間的單向定量縮合，得到的結(jié)合物具有較高的標(biāo)記率。

7.硫氰酸酯衍生物法

利用CSCI2先與標(biāo)記物（或被標(biāo)記物）的-NH2反應(yīng)形成硫氰酸酯衍生物，再與被標(biāo)記物（標(biāo)記物）偶聯(lián)成結(jié)合物。偶聯(lián)的位置主要是賴氨酸殘基的游離氨基上。標(biāo)記反應(yīng)的條件溫和，獲得的結(jié)合物性質(zhì)穩(wěn)定，而且不損失活性。

硫氰酸酯衍生物法

8.O-（羧甲基）羥胺法

抗原結(jié)構(gòu)中的羰基（或經(jīng)過(guò)反應(yīng)形成的羰基）與O-（羧甲基）羥胺作用能縮合成O-羧甲基衍生物。O-羧甲基衍生物利用結(jié)構(gòu)中的羧基與標(biāo)記物中的氨基結(jié)合成結(jié)合物。

O-（羧甲基）羥胺法

9.戊二醛法

戊二醛作為一個(gè)雙功能偶聯(lián)試劑可通過(guò)其兩個(gè)醛基分別與標(biāo)記物及被標(biāo)記物的伯氨基縮合，通過(guò)一個(gè)五碳橋偶聯(lián)成結(jié)合物。由于戊二醛在溶液中不僅以單體形式存在，而且出現(xiàn)大量的聚合體，故能在參與標(biāo)記的雙方分子間構(gòu)成較大的距離，有利于減少在抗原抗體反應(yīng)時(shí)的空間阻礙。因此該方法作為標(biāo)記酶的手段曾得到較多的研究。由于戊二醛法的偶聯(lián)不易定量控制并缺乏特異性，易引起同類物質(zhì)的自身聚合，所以在發(fā)光免疫測(cè)定標(biāo)記中未受到廣泛重視。

戊二醛法

影響標(biāo)記的因素

1.發(fā)光劑的選擇：

發(fā)光免疫測(cè)定法應(yīng)根據(jù)實(shí)際需要和客觀條件的限制來(lái)選擇發(fā)光劑。由發(fā)光劑的結(jié)構(gòu)性質(zhì)選擇相應(yīng)的標(biāo)記方法。在使用環(huán)酰肼類發(fā)光劑作為標(biāo)記物時(shí)，應(yīng)優(yōu)先選用異魯米諾及其衍生物，尤其是帶有側(cè)鏈的衍生物（ABEI、AHEI等）。這不僅是由于參加偶合反應(yīng)的氨基位于支鏈端而減弱了偶合時(shí)空間位阻效應(yīng)，使之更易與蛋白質(zhì)等大分子連接。氨基的烷基化作用可增加芳環(huán)的量子效應(yīng)，減少發(fā)光效率的損失。吖啶酯類發(fā)光劑多選用N-羥基琥珀酰亞胺活化法進(jìn)行標(biāo)記。此類發(fā)光劑具有比魯米諾大的發(fā)光效率，在比較溫和的條件下僅有過(guò)氧化氫和稀堿便可激發(fā)化學(xué)發(fā)光。

2.被標(biāo)記蛋白的性質(zhì)：

抗原作為被標(biāo)記物時(shí)，應(yīng)具有較高的純度和免疫學(xué)穩(wěn)定性。抗體作為被標(biāo)對(duì)象則要求具有較高效價(jià)。同時(shí)需要提純IgG以代替全血清制備結(jié)合物，以減少血清中所含有的某些氧化酶類妨礙結(jié)合物的穩(wěn)定性，也可以排除某些發(fā)光物質(zhì)干擾發(fā)光免疫測(cè)定。

3.標(biāo)記方法的選擇：

標(biāo)記方法之間差異較大，不同方法都有獨(dú)特的反應(yīng)條件和適應(yīng)對(duì)象。熟悉這些方法的原理和應(yīng)用情況正確選擇與發(fā)光劑和被標(biāo)記物結(jié)構(gòu)特點(diǎn)相適應(yīng)的偶聯(lián)方式是順利開(kāi)展發(fā)光免疫測(cè)定法的必要條件。

4.原料比：

在制備發(fā)光劑-IgG結(jié)合物時(shí)，IgG：發(fā)光劑和交聯(lián)劑：IgG的分子濃度比（原料比）能影響結(jié)合物的發(fā)光效率。當(dāng)確定一種交聯(lián)劑后，必須仔細(xì)地選擇它們之間的分子濃度比。選出最佳反應(yīng)的交聯(lián)劑：IgG：發(fā)光劑的反應(yīng)濃度。

5.標(biāo)記率：

指結(jié)合物結(jié)構(gòu)中IgG結(jié)合發(fā)光劑的分子比。由于對(duì)應(yīng)于每一種發(fā)光劑或被標(biāo)記物制備的結(jié)合物都有特定的最佳標(biāo)記率。標(biāo)記率選擇不好會(huì)造成發(fā)光效率低、不易保存和使用等現(xiàn)象。為確保結(jié)合物的發(fā)光效率和穩(wěn)定性，應(yīng)用中應(yīng)當(dāng)根據(jù)發(fā)光劑和被標(biāo)記物的性質(zhì)，通過(guò)實(shí)際實(shí)驗(yàn)選擇出適用的標(biāo)記率。

6.溫度：

對(duì)于比較穩(wěn)定的小分子來(lái)說(shuō)被標(biāo)記物的溫度控制不必太嚴(yán)。而當(dāng)被標(biāo)記物是抗原或抗體蛋白質(zhì)時(shí)，由于蛋白質(zhì)對(duì)熱的不穩(wěn)定性，應(yīng)當(dāng)在保證反應(yīng)進(jìn)行前提下盡量選擇低溫條件，以免在標(biāo)記過(guò)程中造成蛋白質(zhì)分解、變性和喪失活性。

7.純化與保存：

多數(shù)經(jīng)偶合反應(yīng)制備的結(jié)合物使用前都需進(jìn)行純化。其主要目的是除去反應(yīng)系統(tǒng)中存在的未結(jié)合發(fā)光劑和交聯(lián)劑。一般可利用透析法、凝膠過(guò)濾法和鹽析沉淀法等進(jìn)行純化。提純的結(jié)合物應(yīng)及時(shí)測(cè)定蛋白質(zhì)的含量、免疫學(xué)活性和發(fā)光效率等指標(biāo)。由于標(biāo)記過(guò)程的不規(guī)范或存放過(guò)程中可能出現(xiàn)的脫落現(xiàn)象，對(duì)于新制備的或經(jīng)較長(zhǎng)時(shí)間保存的結(jié)合物在使用前都要測(cè)定這三項(xiàng)指標(biāo)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。結(jié)合物一般可分裝保存在4-70℃條件下。最好能經(jīng)過(guò)冰凍干燥保存，這可保存數(shù)年之久不喪失活性。

參考文獻(xiàn)

[1]韓剛毅. 發(fā)光免疫測(cè)定法的標(biāo)記技術(shù)[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 1987, 75(03): 28-32.
[2]林金明, 趙麗霞, 王栩. 化學(xué)發(fā)光免疫分析[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2008, 50-52.
[3]Gadow A, Fricke H, Strasburger C J , et al. Synthesis and Evaluation of Luminescent Tracers and Hapten-Protein Conjugates for Use in Luminescence Immunoassays with Immobilised Antibodies and Antigens. A critical study of macro solid phases for use in immunoassay Systems, Part II[J]. CCLM, 1984.