重組酶聚合酶擴增（Recombinase polymerase amplification reaction，RPA）

自20世紀90年代初以來，大量的等溫核酸擴增方法涌現，有基于核酸序列的擴增（NASBA，又稱轉錄介導擴增，TMA）、信號介導的核糖核酸擴增技術（SMART）、解旋酶依賴性擴增（HDA）、重組酶聚合酶擴增（RPA）、滾環擴增（RCA）、多重置換擴增（MDA）、環介導的等溫擴增（LAMP）和鏈置換擴增（SDA）。其中RPA反應條件溫和，擴增效率高，非常適合臨床快速診斷、食品檢測、疫情防控、工業應用、現場實時檢測等應用。

1.簡介

與PCR等溫擴增方法相比，RPA具有操作簡單、反應速度快、對設備要求低等優點。在靈敏度方面，RPA可以檢測最低水平樣品中的痕量核酸。在一些研究中，RPA甚至可以檢測到PCR無法檢測到的低濃度DNA。在特異性方面，RPA可以從不同物種和標本類型的基因組DNA中識別和擴增靶基因。RPA抗干擾能力強，檢測結果可與PCR高度一致。此外，RPA可以在37-42°C下運行，無需復雜的溫度控制設備，非常適合資源匱乏環境下的現場檢測，并可以在20 min內得到檢測結果，有利于樣品的大規模篩選和快速檢測。

2.反應機理

重組酶聚合酶擴增技術通過模擬DNA體內擴增，在等溫條件下產生目的片段。該技術主要依賴重組酶、單鏈結合蛋白和鏈置換DNA聚合酶。重組酶能夠不通過加熱就解開雙鏈DNA。重組酶聚合酶擴增反應開始時，重組酶在ATP的參與下結合引物，形成核酸蛋白復合體，這些復合體能夠掃描與引物序列互補的目標雙鏈DNA。接著，核酸蛋白復合體侵入5'端位點形成D狀環。單鏈結合蛋白與被置換單鏈結合使其穩定。同時，重組酶離開寡核苷酸的3'端，降解后被DNA聚合酶利用。之后，鏈置換DNA聚合酶結合在核酸蛋白復合體的游離3'端，進行鏈延伸，形成新的互補鏈。在鏈延伸的過程中，新合成的單鏈與原始互補鏈配對。以上步驟循環進行，實現DNA的指數增長。

RPA-Fig1

Fig. 1 重組酶蛋白與每個引物形成復合物（A），掃描DNA的同源序列（B）。然后通過重組酶（C）的鏈置換活性將引物插入同源位點，單鏈結合蛋白穩定了置換的DNA鏈（D）。隨后重組酶分解，引物3'端可進入置換DNA聚合酶（E）的鏈，從而延長引物（F），通過循環重復該過程實現了指數放大。

3.RPA檢測的影響因素

RPA的突出之處源于其特定的反應成分和機理。RPA檢測的細微差別取決于內在因素（如引物、探針和核酸模板的設計），并與外在因素有關（如反應溫度和攪拌、對錯配的耐受性、抑制劑和背景DNA）。此外，RPA過程中的核酸標記、RPA擴增產物的清理和擴增后處理也是實現RPA檢測的重要細節。

3.1 RPA模板、引物、探針及其設計

RPA試驗中DNA模板的GC含量應在40%-60%之間，并且應避免長同質聚合物軌道、少量直接/反向重復和回文序列；引物GC含量應在30%-70%之間，5′端應避免鳥嘌呤長跡，推薦胞苷類；引物3′端推薦添加鳥嘌呤和胞苷，以提高性能。此外需要避免引物和探針之間的重疊，減少對擴增效率的影響。

模板
RPA最初被證明是一種DNA核酸擴增方法，后來發現通過添加逆轉錄酶，RNA 也可以作為模板。無論和核酸模板類型如何，在試驗中推薦RPA擴增子長度應低于500個核苷酸，大多數RPA擴增子長度在100到250個核苷酸之間，在此區間內會產生快速有效的擴增。
引物
與PCR不同，RPA引物的長度相對較長（建議至少為30個核苷酸，但通常在32至35個核苷酸之間）。較短的PCR引物（通常在18到25個核苷酸之間）也可以用于RPA反應，但可能會降低反應速度和靈敏度。
探針
TaqMan等傳統探針不能用于RPA，PCR Taq聚合酶也與擴增系統不兼容，對于實時檢測通常使用2種探頭，RPA-exo或fpg。exo探針是一個長寡核苷酸（46-52個堿基），帶有內部堿基類似物（如四氫呋喃，THF），位于熒光基團和淬滅劑之間，具有封閉的3'末端。非堿性殘基用作酸外切酶的底物，只有在探針與靶序列結合后才能切割THF，熒光產生通常在RPA反應期間的5-10分鐘內產生可檢測的信號。與exo探針相比，fpg探針更短（32-35個堿基），它具有5′淬滅劑和下游5-6個堿基的熒光團，通過C-O-C接頭連接到非堿性核苷酸的核糖上。fpg是一種8-氧鳥嘌呤DNA糖基化酶，它識別并切割熒光團，同時留下2個不可延伸的序列，是與核酸外切酶不同的催化模式。

3.2 溫度和攪拌的影響

反應溫度和反應過程中的攪拌是兩個重要的外在影響因素。

溫度

推薦的RPA反應溫度在37-42℃之間，但在低至25℃的溫度下，經過RPA放大和隨后的側流條帶檢測，仍然可以產生正信號。此外，環境溫度對RPA反應也有影響，當環境溫度低于10℃時，RPA反應不穩定，但延長反應時間可以提高陽性結果的可得性。
攪拌與震蕩

反應溫度為RPA中的酶提供了合適的工作環境，而攪拌則可以增加均質溶液反應中RPA組分之間的相互作用。建議對RPA反應執行兩次混合步驟，一次在過程開始時，另一次在反應4分鐘后。前者是混合所有RPA試劑來引發反應，后者是為了防止反應試劑局部耗盡，從而提高反應速率。
此外，在整個RPA反應過程中不斷震蕩混勻，可以進一步加快RPA反應速度，特別是當模板濃度接近檢測極限時，可獲得更穩定的陽性結果，提高靈敏度。

3.3 對錯配、抑制劑和背景DNA的耐受性

除了溫度和攪拌，對錯配、抑制劑和背景DNA的耐受性也是實現高效、靈敏RPA反應的重要因素。

錯配

RPA具有耐錯配能力，引物5′端或中心的錯配只會輕微地影響RPA反應，由于聚合酶從3′端延伸引物和探針，所以位于3′端的錯配對反應有顯著影響。然而，一般的RPA錯配容忍度（在引物3′端之外）可能是有利的，因為它針對高度多態的靶標引物設計提供一定的靈活性。在高度多態的靶標中，很難定位長期保守的靶區，所以這種錯配耐受性的缺點是傾向于對密切相關的物種進行非特異性檢測。
抑制劑和背景DNA

在測試臨床或現場樣品時，可能會在樣品制備和處理時引入干擾物質（如抑制劑），影響核酸擴增。研究表明RPA對一些聚合酶抑制物有耐受性，例如，當血紅蛋白（20gL^-1）、肝素（0.5U）、尿液（1.25%)時對RPA反應無影響；但在十二烷基硫酸鈉（0.05%/v/v）和尿液（10%）存在下反應被完全抑制，同時在模板濃度接近檢測極限時，反應更容易受到抑制劑影響。除了對抑制劑的耐受性外，RPA還能夠在背景DNA存在的情況下擴增靶核酸。

4.RPA的應用

4.1 細菌檢測中的應用

基于RPA和側向流試紙條的雙重檢測生物傳感器來檢測霍亂弧菌和創傷弧菌。該生物傳感器具有靈敏度和特異性高、反應時間短、設備簡單等優點，非常適合基層醫院和現場檢測。此外，用于檢測銅綠假單胞菌和副溶血性弧菌的重組酶聚合酶擴增結合側向流試紙條（RPA-LFS）也已經過實驗驗證。

4.2 在真菌檢測中的應用

目前，醫學上主要通過形態和生理表型對真菌進行檢測。此方法檢測時間長，陽性檢出率低。例如新型隱球菌是一種有條件的病原體，大多數患者有中樞神經系統感染癥狀，死亡率高。檢測新型隱球菌的常用方法是墨水染色和病原體培養。培養法是檢測的金標準，但培養時間長不利于臨床快速診斷。墨跡染色法受試樣類型限制，陽性檢出率低。基于這種情況建立了用于目視快速檢測新型隱球菌/格特隱球菌的RPA-LFS。

4.3 在病毒檢測中的應用

逆轉錄重組酶聚合酶擴增（RT-RPA）和RPA-LFS方法比RPA-CRISPR更早應用，也廣泛用于病毒檢測。RPA-LFS還可以聯合檢測流行性出血性疾病病毒、血清型病毒和呼吸道合胞病毒。由于一些病毒（如胡椒黃斑病毒）在其復制周期中具有兩個階段的DNA和RNA，建立了RPA和RT-RPA來檢測病毒。RPA在病毒檢測中的應用往往首先需要逆轉錄。如果將逆轉錄和RPA擴增分為兩個步驟，則氣溶膠產生和污染的風險增加。

4.4 在寄生蟲檢測中的應用

RPA和實時熒光的結合允許實時檢測過程，并且比RPA-LFS具有更低的交叉污染風險。RT-RPA還可以針對不同寄生蟲的特定基因設計引物探針，以建立多個RT-RPA。目前多個RT-RPA已成功應用于同時快速檢測馬泰勒氏菌和卡巴利巴貝蟲。除了傳統的熒光探針外，熒光染料SYBR Green I與RPA相結合也常用于檢測寄生蟲，例如諾氏瘧原蟲。RPA已成功應用于檢測許多寄生蟲，但應用尚未廣泛。目前的研究大多是相對簡單的RPA-LFS、實時熒光RPA等，RPA與其他方法相結合的進一步研究相對較少。

4.5 在耐藥基因檢測中的應用

抗生素的過度使用會導致細菌耐藥，給臨床疾病的診斷和治療帶來巨大挑戰。細菌耐藥監測對指導臨床用藥、避免或延緩耐藥菌株的產生具有重要意義，RPA的快速、高效、簡單優勢在抗性基因檢測中發揮著重要作用。RPA具有與PCR相當的檢測能力，有時其靈敏度甚至高于PCR。

4.6 在轉基因食品檢測中的應用

目前，基于蛋白質水平和核酸水平檢測轉基因作物的方法主要有兩種。前者受蛋白質變性、檢測試劑等原因的限制，無法滿足大規模轉基因作物的檢測。后者的PCR方法具有較高的靈敏度和特異性，但PCR需要復雜且昂貴的熱循環儀器，操作流程復雜，不適合現場檢測。建立快速便捷的檢測方法將大大提高轉基因食品的檢測效率。RPA方便高效，非常適合基層單位、倉庫、田間現場轉基因檢測。然而，只有少數公司銷售RPA試劑，這限制了其在轉基因食品大規模篩選中的應用。

4.7 在SARS-CoV-2檢測中的應用

當前檢測SARS-CoV-2的主要方法包括實時熒光定量PCR（qRT-PCR）、數字PCR和各種等溫擴增方法。其中，RT-qPCR是應用最廣泛的方法，但對設備、檢測條件、人員操作要求較高。通過將RPA和LFS檢測系統集成到單個微流控芯片中，建立了用于快速檢測SARS-CoV-2的微流控集成側流RPA。封閉的微流控芯片克服了氣溶膠污染，簡便的分析系統降低了設備成本和人工成本。RPA還可以通過添加熒光染料SYBR Green I實時或在終點檢測SARS-CoV-2，不需要打開管子，避免氣溶膠污染，并可用肉眼觀察測試結果，且成本也低于RPA-LFS和RT-RPA。RPA對設備和現場檢測環境要求較低，非常適合SARS-CoV-2的現場篩查。

參考文獻

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